發(fā)布時(shí)間：2017-10-11
2017年9月20日，《eLife》期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為《自由行為下幼年斑馬魚(yú)快速全腦神經(jīng)活動(dòng)成像》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心王凱研究組（神經(jīng)科學(xué)研究所）與溫泉研究組（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度國家實(shí)驗室）合作完成。該研究發(fā)展了一種新型三維在體成像技術(shù)——擴增視場(chǎng)光場(chǎng)顯微技術(shù)（eXtended field-of-view Light Field Microscopy, XLFM），可以對斑馬魚(yú)幼體的全腦神經(jīng)元進(jìn)行高速神經(jīng)活動(dòng)功能成像。研究團隊將該成像技術(shù)與一套快速三維追蹤系統結合，成功實(shí)現了對自由行為下的幼年斑馬魚(yú)進(jìn)行快速全腦神經(jīng)元活動(dòng)記錄，并首次捕捉到斑馬魚(yú)幼魚(yú)在捕食行為下高時(shí)空分辨率的全腦神經(jīng)活動(dòng)。該研究打破了了長(cháng)久以來(lái)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域只能對頭部固定的活體斑馬魚(yú)進(jìn)行全腦功能神經(jīng)活動(dòng)研究這一局限，為研究斑馬魚(yú)幼魚(yú)的感知運動(dòng)神經(jīng)環(huán)路提供了一種強有力的工具。
圖1. XLFM斑馬魚(yú)幼魚(yú)全腦成像。（a）XLFM示意圖。微透鏡陣列與物鏡的后光瞳平面共軛。激發(fā)光為470 nm的藍色激光。（b-c）不同豎直位置的點(diǎn)在相機上形成不同形狀的圖像，這些二維圖像編碼了物體的三維信息。（d）全腦細胞核標記GCaMP6f（huc：h2b-gcamp6f）的斑馬魚(yú)幼魚(yú)的全腦最大強度投影（MIP）。（e）在t=0時(shí)刻光刺激后斑馬魚(yú)幼魚(yú)不同神經(jīng)元的熒光活動(dòng)圖，根據神經(jīng)元的響應時(shí)間先后順序進(jìn)行排序。（f）（e）中的選定的神經(jīng)元根據其響應的起始時(shí)間被標記了不同的顏色?？潭葹?00微米。
系統神經(jīng)科學(xué)的一個(gè)中心目標就是理解動(dòng)物的神經(jīng)環(huán)路活動(dòng)與行為之間的聯(lián)系。近年涌現的一批光學(xué)手段（例如鈣信號熒光成像、光遺傳學(xué)等）已經(jīng)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域取得了巨大的成功。在此過(guò)程中，斑馬魚(yú)幼魚(yú)因其體積小、光學(xué)透明、行為豐富等特征成為一種理想的模式動(dòng)物。而光片顯微技術(shù)（light-sheet microscopy）、雙光子顯微技術(shù)（two-photon microscopy）已經(jīng)在揭示斑馬魚(yú)行為神經(jīng)環(huán)路機制上顯示出了強大的潛力。
然而，現有的斑馬魚(yú)全腦神經(jīng)活動(dòng)的記錄都是在頭部固定的活體斑馬魚(yú)上完成的。雖然近年發(fā)展的虛擬現實(shí)技術(shù)（virtual reality）可以通過(guò)監測斑馬魚(yú)運動(dòng)神經(jīng)信號并在斑馬魚(yú)周?chē)鷮?shí)時(shí)反饋相應的虛擬圖像來(lái)模擬自由運動(dòng)的場(chǎng)景，但是這種技術(shù)無(wú)法模擬一些較復雜的行為，例如捕食行為。更重要的是，在虛擬現實(shí)中，斑馬魚(yú)的本體反饋被忽略，而這些本體反饋在感知運動(dòng)行為中扮演著(zhù)重要角色。因此，發(fā)展一套適用于自由行為下的斑馬魚(yú)幼魚(yú)全腦神經(jīng)活動(dòng)記錄的系統成為斑馬魚(yú)研究領(lǐng)域一個(gè)急迫的任務(wù)。
在此之前，自由行為下的全腦成像技術(shù)已經(jīng)在其他小型動(dòng)物例如秀麗線(xiàn)蟲(chóng)上實(shí)現。然而，由于斑馬魚(yú)幼魚(yú)運動(dòng)時(shí)的加速度和速度極快，準確快速地對其腦部實(shí)現三維實(shí)時(shí)追蹤無(wú)論是對系統硬件還是算法上都提出了很高的要求。此外，由于斑馬魚(yú)全腦的體積相對較大，如何在斑馬魚(yú)運動(dòng)情況下實(shí)現對全腦的快速成像也是一個(gè)新的挑戰。對此，研究團隊從兩方面入手。一方面，他們開(kāi)發(fā)了一套高速三維追蹤系統，成功解決了對快速運動(dòng)的斑馬魚(yú)頭部實(shí)時(shí)追蹤的問(wèn)題。在追蹤系統中，他們分別利用高速相機和一組特殊設計微透鏡實(shí)時(shí)監測斑馬魚(yú)頭部的水平和豎直位置，并將此位置反饋給高速位移臺和壓電陶瓷做水平與豎直方向的位置校正。另一方面，針對成像方法，他們創(chuàng )造性地發(fā)展出了一種新型體成像技術(shù)——擴增視場(chǎng)光場(chǎng)顯微技術(shù)（XLFM）。該技術(shù)利用一組放置在成像系統傅立葉平面上的微透鏡陣列，可以同時(shí)將物體不同方向的投影成像到相機上，相機采集到的圖像經(jīng)過(guò)特殊算法重構物體的三維信息。該成像方法不僅成像速度極快，可以以77 Hz的速度記錄斑馬魚(yú)幼魚(yú)的全腦活動(dòng)，而且相較之前的體成像技術(shù)，空間分辨率得到了大幅提高，達到了3.4 μm × 3.4 μm × 5 μm，在斑馬魚(yú)全腦中已經(jīng)接近單細胞分辨率。至此，該工作成功解決了斑馬魚(yú)幼魚(yú)的追蹤與成像這兩大問(wèn)題。
進(jìn)一步地，他們將XLFM與高速三維追蹤系統結合，成功捕捉到了斑馬魚(yú)幼魚(yú)捕食行為下的全腦活動(dòng)。斑馬魚(yú)的捕食行為由于涉及動(dòng)機、感知、決策、運動(dòng)控制、反饋等一系列復雜的神經(jīng)環(huán)路功能，一直以來(lái)都受到神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注。然而，長(cháng)久以來(lái)，人們受限于研究工具一直無(wú)法深入研究捕食行為背后的神經(jīng)環(huán)路機制。而該工作的完成恰恰填補了這一缺陷，這將極大地促進(jìn)對斑馬魚(yú)幼魚(yú)捕食等復雜行為神經(jīng)機理的研究，對人們更好地理解感知運動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路工作機理具有重要意義。該技術(shù)進(jìn)一步拓展后亦可大規模監測其他小型動(dòng)物神經(jīng)系統的活動(dòng)。
圖2. 捕食行為中的斑馬魚(yú)幼魚(yú)全腦成像。（a）在捕食行為中的6個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的全腦活動(dòng)（上圖）和對應的低被行為（下圖）。用于定量分析行為的一些參數包括：斑馬魚(yú)-草履蟲(chóng)夾角、兩眼會(huì )聚角、頭部朝向、斑馬魚(yú)-草履蟲(chóng)距離d。（b）全神經(jīng)系統胞質(zhì)GCaMP6s表達的斑馬魚(yú)全腦最大強度投影（MIP），四個(gè)感興趣的腦區的邊界已經(jīng)被標出。（c）根據熒光信號亮度得到的四個(gè)腦區在捕食過(guò)程中的神經(jīng)活動(dòng)（上），以及對應的行為參數的變化（中、下）。
該工作由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心王凱研究員、杜久林研究員與溫泉研究員合作完成，神經(jīng)所助研叢林、杭葦、科大本科生王澤冠、博士生柴宇明為共同第一作者，王凱研究員、溫泉研究員為共同通訊作者，杜久林組副研究員尚春峰、王凱組研究生白璐和溫泉組研究生楊文斌也做出了重要貢獻。
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